高敏PCR試劑盒(熔解確認版) ——快靈高敏試劑盒“PLUS”!
發布時間 : 2021-06-28 16:07:19自2020年10月上海快靈發布“非洲豬(zhu)瘟(wen)高敏(min)PCR試劑(ji)盒(he)”(下稱高敏(min)試劑(ji)盒(he))以(yi)來,其出色的(de)靈敏(min)度、敏(min)感性、特異性及穩定性迅速被廣大豬(zhu)場實(shi)驗(yan)室認可。隨著熒光PCR相(xiang)關技術(shu)的(de)普及以(yi)及用戶群體的(de)增大,部(bu)分之前(qian)未被重視的(de)問題(ti)也逐(zhu)漸顯露(lu)出來。本篇我們(men)探討下各廠(chang)家都諱莫(mo)如深(shen)的(de)一(yi)個點——“假(jia)陽”問題(ti),以(yi)及相(xiang)應(ying)的(de)解決方案。
“假(jia)(jia)(jia)陽(yang)”問題,事(shi)實上(shang)在(zai)熒光PCR領域并不(bu)少見,而(er)造成假(jia)(jia)(jia)陽(yang)產生(sheng)的(de)(de)原因也是紛繁(fan)復雜(za):如(ru)操(cao)作不(bu)當污(wu)(wu)染、環(huan)境氣溶膠污(wu)(wu)染或(huo)者試(shi)(shi)(shi)(shi)劑(ji)(ji)(ji)生(sheng)產過程(cheng)污(wu)(wu)染等。本文所(suo)要(yao)探討(tao)的(de)(de)“假(jia)(jia)(jia)陽(yang)”,主要(yao)指因試(shi)(shi)(shi)(shi)劑(ji)(ji)(ji)特異性(xing)導致的(de)(de)假(jia)(jia)(jia)陽(yang),換句話說(shuo),即文中所(suo)提的(de)(de)“假(jia)(jia)(jia)陽(yang)”,與操(cao)作者、儀器(qi)、環(huan)境均(jun)無關(guan),只(zhi)與試(shi)(shi)(shi)(shi)劑(ji)(ji)(ji)盒內(nei)的(de)(de)試(shi)(shi)(shi)(shi)劑(ji)(ji)(ji)有關(guan)。那(nei)么試(shi)(shi)(shi)(shi)劑(ji)(ji)(ji)盒中到(dao)底(di)什(shen)么與“假(jia)(jia)(jia)陽(yang)”相關(guan)呢(ni)?縱觀商業化的(de)(de)非(fei)瘟(wen)病毒PCR檢(jian)測試(shi)(shi)(shi)(shi)劑(ji)(ji)(ji)盒,其中都會提及(ji)一個重要(yao)參數——特異性(xing)。
何(he)為特異(yi)性(xing)呢(ni)?在PCR擴(kuo)(kuo)增(zeng)(zeng)過(guo)程中,如果我們(men)要(yao)擴(kuo)(kuo)增(zeng)(zeng)的(de)非洲豬瘟(wen)(wen)DNA片(pian)段在整條DNA鏈(lian)上不止出(chu)現了一次,或者樣品(pin)中混(hun)有(you)的(de)其他(ta)物種、細(xi)胞(bao)或病(bing)毒的(de)DNA中含有(you)類似的(de)DNA片(pian)段,則(ze)可能會(hui)將其他(ta)片(pian)段擴(kuo)(kuo)增(zeng)(zeng)出(chu)來(lai),那最后儀(yi)器顯示出(chu)來(lai)的(de)陽(yang)性(xing)結(jie)果就(jiu)不一定(ding)是非瘟(wen)(wen)病(bing)毒DNA造成的(de),于是陽(yang)性(xing)結(jie)果也就(jiu)變(bian)成了假(jia)陽(yang)。因此,通俗來(lai)說,特異(yi)性(xing)反(fan)應的(de)是試(shi)劑(ji)盒能擴(kuo)(kuo)增(zeng)(zeng)出(chu)特定(ding)DNA片(pian)段的(de)性(xing)能,特異(yi)性(xing)越(yue)低(di),則(ze)試(shi)劑(ji)盒擴(kuo)(kuo)增(zeng)(zeng)其他(ta)片(pian)段的(de)概率就(jiu)越(yue)大,即(ji)“假(jia)陽(yang)”幾(ji)率更大。
市售的眾多非瘟病毒PCR檢測試(shi)(shi)劑(ji)盒中,絕大多數廠商在宣(xuan)傳其試(shi)(shi)劑(ji)盒特(te)異(yi)性時均會標注>99%,最低(di)也(ye)不會低(di)于98%,快靈的高敏試(shi)(shi)劑(ji)盒也(ye)是(shi)(shi)如此,特(te)異(yi)性可達到99.9%,屬實是(shi)(shi)已(yi)經(jing)做到了(le)(le)極(ji)限,即使PCR技術發展至(zhi)今,因為模(mo)板DNA的不確定(ding),依然無法保證100%的特(te)異(yi)性。也(ye)正(zheng)因此,特(te)異(yi)性,也(ye)就是(shi)(shi)假(jia)陽的問題是(shi)(shi)被(bei)大家忽視了(le)(le)。
在服務客(ke)戶(hu)的(de)過程中(zhong),我們發現(xian)很多(duo)客(ke)戶(hu)在進行非瘟病毒檢(jian)測遇到極弱(ruo)樣(yang)本或疑似樣(yang)本時,對于(yu)陽(yang)性場,往往遵循的(de)是“寧殺(sha)錯,不放(fang)過(guo)”,而對于陰性場,往(wang)往(wang)帶來(lai)心(xin)理的(de)恐慌,需要(yao)確(que)認到底是不是陽性。的(de)確(que),隨著非(fei)瘟一波波的(de)襲來(lai),各檢測單位(wei)的(de)工作量都史(shi)無前例的(de)倍增,再重新來(lai)一遍的(de)全(quan)面(mian)(mian)復核,顯然是對人(ren)力和成本的(de)巨大考驗。面(mian)(mian)對這樣的(de)大環境,快靈人(ren)陷入了沉思。
“我們為什么要寧殺(sha)錯(cuo)?”
“當(dang)真沒有辦法消除假陽么?”
帶著這樣(yang)的問(wen)題,我們(men)開(kai)始了新的一(yi)輪(lun)又一(yi)輪(lun)的嘗試:提升試劑盒的靈(ling)敏度、將特(te)異性由99%提升至99.9%……或許,我們(men)可以把眼界(jie)放寬,不局限于(yu)單純的擴(kuo)增?
于(yu)是,高敏試劑(ji)(ji)盒上市半(ban)年(nian)后,我(wo)們在高敏試劑(ji)(ji)盒基礎之上研發出其“升級版(ban)”——快靈高敏試劑(ji)(ji)盒(熔解確認版(ban))。
快靈高敏試(shi)(shi)劑盒(熔解(jie)確認(ren)版),其(qi)性(xing)能參數與高敏試(shi)(shi)劑盒一致,我們(men)同樣保證(zheng)其(qi)靈敏度、敏感性(xing)、穩定(ding)性(xing)、特(te)異(yi)性(xing)處在行業頂尖水平,確保客戶(hu)可(ke)以第一時間檢測出陽性(xing)樣本。包括其(qi)操作、擴(kuo)增階段也與高敏試(shi)(shi)劑盒別無二致,至此(ci),我們(men)可(ke)以把(ba)快靈高敏試(shi)(shi)劑盒(熔解(jie)確認(ren)版)等同于高敏試(shi)(shi)劑盒。詳見表1:
表1:高(gao)敏試劑盒(he)與(yu)假陽確認試劑盒(he)基本性(xing)能參(can)數對比
性能 | 高敏試(shi)劑盒 | 高敏(min)試劑盒(假(jia)陽確認(ren)版) |
靈敏度(du) | 400copies/mL | 400copies/mL |
敏感性 | ≥99.9% | ≥99.9% |
特(te)異(yi)性(xing) | ≥99.9% | ≥99.9% |
穩定性 | CV<3% | CV<3% |
規格 | 50T/盒 | 50T/盒 |
反應體系 | 25μL | 25μL |
反應時長 | 55min | 55min(單(dan)擴(kuo)增) 70min(擴增(zeng)+熔解(jie)) |
UDG酶(mei) | 有 | 有(you) |
內(nei)標 | 有(you) | 有 |
但(dan),重點來(lai)了!快(kuai)靈是怎么(me)做到的?快(kuai)靈高敏試劑盒(熔解(jie)(jie)確認版)突破性地使用了一個新的反應程序——熔解(jie)(jie)曲線(xian)。熔解(jie)(jie)曲線(xian)能鑒(jian)(jian)別不同的DNA片段(duan),依(yi)靠的不是Ct.值(zhi),而是其特有的熔解(jie)(jie)峰,即Tm值(zhi),即使一個DNA片段(duan)中僅(jin)相差一個堿基,都能導致Tm值(zhi)變動。依(yi)靠Tm值(zhi)的判定(ding)就可以確認之(zhi)前擴增陽性的非(fei)瘟(wen)樣本(ben)是否為(wei)真的非(fei)瘟(wen)陽性,以此達(da)到鑒(jian)(jian)別假陽,消(xiao)除客戶疑(yi)慮的目(mu)的。
圖(tu)1:擴增曲(qu)線(xian)Ct.值(zhi)判讀陰陽 圖(tu)2:熔解曲(qu)線(xian)檢測疑似/弱陽樣本,排除假陽
非瘟新(xin)形勢下,除(chu)了(le)要求(qiu)試劑盒(he)更(geng)(geng)早的(de)檢(jian)測出(chu)陽(yang)性,更(geng)(geng)需要真(zhen)正“精準”檢(jian)測。快靈(ling)高敏試劑盒(he)(熔(rong)解確認版)除(chu)了(le)超高的(de)靈(ling)敏度、特異性,更(geng)(geng)是(shi)“自帶”熔(rong)解曲線,讓假陽(yang)無(wu)處可藏,讓弱陽(yang)“站得住腳(jiao)”,真(zhen)正做到打消客戶疑慮,真(zhen)正做到“不(bu)殺錯、不(bu)放過”。