多管齊下,嚴防非洲豬瘟變異株
發布時間 : 2021-06-28 16:01:50一、非洲(zhou)豬瘟(wen)變(bian)異(yi)株的(de)定義
非(fei)洲豬(zhu)瘟(wen)(wen)變(bian)(bian)異株(zhu)(zhu)(zhu)包括基因缺失株(zhu)(zhu)(zhu)、自然(ran)變(bian)(bian)異株(zhu)(zhu)(zhu)、自然(ran)弱(ruo)毒(du)(du)(du)株(zhu)(zhu)(zhu)等(deng),與2018年傳入(ru)的非(fei)洲豬(zhu)瘟(wen)(wen)毒(du)(du)(du)株(zhu)(zhu)(zhu)相比(bi),該(gai)類(lei)毒(du)(du)(du)株(zhu)(zhu)(zhu)的基因組序列、致病(bing)力(li)等(deng)發(fa)生明顯變(bian)(bian)化。生豬(zhu)感染該(gai)類(lei)毒(du)(du)(du)株(zhu)(zhu)(zhu)后,潛(qian)伏期延長,臨床表現(xian)輕微,后期可出現(xian)關(guan)節(jie)腫脹、皮膚出血(xue)型壞(huai)死(si)灶,感染母豬(zhu)產(chan)仔性(xing)(xing)能下降(jiang)、死(si)淘率增高(gao),出現(xian)流產(chan)死(si)胎/木乃伊胎等(deng)。與傳統的流行毒(du)(du)(du)株(zhu)(zhu)(zhu)相比(bi),生豬(zhu)感染該(gai)類(lei)毒(du)(du)(du)株(zhu)(zhu)(zhu)后排毒(du)(du)(du)滴度低、間隙性(xing)(xing)排毒(du)(du)(du),難(nan)以早期發(fa)現(xian)。
二、監測(ce)方法(fa)
(一(yi))加強(qiang)臨床巡視(shi)
時(shi)(shi)刻(ke)關(guan)注豬(zhu)(zhu)(zhu)場各個(ge)環節豬(zhu)(zhu)(zhu)只異常(chang)情況,想方設法提升飼養人員(yuan)責任心,一旦(dan)發(fa)現(xian)(xian)豬(zhu)(zhu)(zhu)只出(chu)現(xian)(xian)嗜睡、輕觸不起、采食量(liang)減少,發(fa)熱(re)、皮(pi)膚發(fa)紅(hong)、關(guan)節腫(zhong)脹/壞死(si)、咳喘、腹式呼吸(xi),育肥豬(zhu)(zhu)(zhu)死(si)淘率增高(gao),母(mu)豬(zhu)(zhu)(zhu)流產或出(chu)現(xian)(xian)死(si)胎/木乃伊胎等可(ke)疑臨床表現(xian)(xian)時(shi)(shi),應第(di)一時(shi)(shi)間采樣(yang)檢(jian)測。
(二)改進主動監測
每周對豬(zhu)群(qun)進(jin)行病(bing)原和抗(kang)體檢測。在(zai)豬(zhu)群(qun)進(jin)行疫苗(miao)接種、轉群(qun)、去(qu)勢,或(huo)母豬(zhu)分娩后,應進(jin)行采(cai)樣(yang)檢測。豬(zhu)場(chang)出現風險暴露或(huo)周邊豬(zhu)場(chang)出現感染(ran)時,按(an)需進(jin)行采(cai)樣(yang)檢測。
(三)抽樣策略
對(dui)可疑豬的同舍(she)(she)和關聯舍(she)(she)豬群(qun),采(cai)(cai)集(ji)深(shen)部咽拭子和抗凝血,進行(xing)(xing)病(bing)原(yuan)(yuan)檢(jian)測(ce),必要(yao)時采(cai)(cai)集(ji)血清進行(xing)(xing)抗體檢(jian)測(ce)。對(dui)可疑豬及臨近豬接觸的地(di)面、欄桿,以及舍(she)(she)內(nei)人(ren)員接觸的物品(pin)等,采(cai)(cai)集(ji)環境樣(yang)品(pin)進行(xing)(xing)病(bing)原(yuan)(yuan)檢(jian)測(ce)。病(bing)原(yuan)(yuan)檢(jian)測(ce)如果混(hun)檢(jian),建議混(hun)樣(yang)數量不(bu)超過5個;抗體檢(jian)測(ce)不(bu)得混(hun)樣(yang)。
(四)樣品(pin)選(xuan)擇
1. 對可疑(yi)豬,按檢(jian)出概(gai)率(lv)高低(di)排序,依次采集深部咽拭(shi)子、前(qian)腔靜(jing)脈抗(kang)凝血(EDTA)或尾根血、口鼻拭(shi)子。
2. 對(dui)分(fen)娩母豬,應采(cai)集(ji)臍(qi)帶(dai)血、胎衣;對(dui)死胎和流(liu)產胎兒,應采(cai)集(ji)淋巴結(jie)、脾臟等組織樣品。
3. 對病死豬,優(you)選采集部位為(wei)淋巴結、脾臟(zang)、骨(gu)髓(sui)和肺(fei)臟(zang)。
4. 血(xue)清樣本,按常規(gui)方法制(zhi)備。
三、檢測方法及配套
(一(yi))采(cai)樣
豬場用戶在進行環(huan)境樣(yang)監測或者群體(ti)(ti)普(pu)查時,可在采(cai)樣(yang)時使用快靈的軟(ruan)拭子和多(duo)腔體(ti)(ti)病(bing)毒采(cai)樣(yang)管進行高效(xiao)采(cai)樣(yang)及混樣(yang)。
軟拭子(zi)頭(tou)部具有彈性,彈性絨毛拭子(zi)頭(tou)較(jiao)容易彎曲來(lai)適應豬(zhu)場不同的異性部位,增大采樣接觸面(mian)積,其面(mian)積比普通紡錘形拭子(zi)多2-3倍,能更多采集目標樣品。
多腔(qiang)(qiang)(qiang)體采(cai)樣(yang)(yang)(yang)(yang)管(guan)不同于(yu)市面(mian)上(shang)傳統的(de)采(cai)樣(yang)(yang)(yang)(yang)管(guan),其內部結構分(fen)別為洗(xi)(xi)滌(di)(di)腔(qiang)(qiang)(qiang)及擠(ji)存(cun)腔(qiang)(qiang)(qiang),洗(xi)(xi)滌(di)(di)腔(qiang)(qiang)(qiang)體內設有多個(ge)豎向刮擦片,對進(jin)入腔(qiang)(qiang)(qiang)體中旋轉(zhuan)的(de)拭(shi)子(zi)進(jin)行(xing)接(jie)觸刮擦,幫助(zhu)絨(rong)毛(mao)表面(mian)的(de)樣(yang)(yang)(yang)(yang)品(pin)洗(xi)(xi)脫釋放(fang)。多個(ge)擠(ji)存(cun)錢腔(qiang)(qiang)(qiang)可(ke)以最多十根軟(ruan)(ruan)拭(shi)子(zi),釋放(fang)了樣(yang)(yang)(yang)(yang)本(ben)后將拭(shi)子(zi)插入洗(xi)(xi)滌(di)(di)腔(qiang)(qiang)(qiang)上(shang)部的(de)擠(ji)壓(ya)腔(qiang)(qiang)(qiang),可(ke)將彈性植(zhi)絨(rong)拭(shi)子(zi)吸(xi)附的(de)洗(xi)(xi)脫液(ye)(ye)擠(ji)壓(ya)出來并從(cong)縫(feng)隙部位回流到洗(xi)(xi)滌(di)(di)腔(qiang)(qiang)(qiang)。相比傳統采(cai)樣(yang)(yang)(yang)(yang)管(guan),僅用(yong)少于(yu)1/5容積的(de)液(ye)(ye)體就能充分(fen)對拭(shi)子(zi)樣(yang)(yang)(yang)(yang)品(pin)進(jin)行(xing)洗(xi)(xi)滌(di)(di),能直接(jie)提高采(cai)樣(yang)(yang)(yang)(yang)溶液(ye)(ye)病原濃度(du)達(da)5-6倍。
(二)病原(yuan)檢(jian)測方法
原(yuan)則(ze)上參照“農(nong)辦牧〔2020〕39號”附(fu)件《非(fei)洲豬瘟病毒流行(xing)株與基因缺失株鑒別(bie)檢測規范(fan)》。
對采集(ji)的(de)樣本進行核(he)酸提取,可(ke)選用快靈的(de)手(shou)動柱法(fa)提取試劑(ji)盒(he),樣本量太大可(ke)使用快靈磁珠提取試劑(ji)盒(he)。
擴(kuo)增時建議選用快靈ASFV流(liu)行株/基(ji)因缺失變異株鑒(jian)(jian)別(bie)(bie)試(shi)劑盒(he),即(ji)P72/MGF/CD2V鑒(jian)(jian)別(bie)(bie)試(shi)劑盒(he)(下稱鑒(jian)(jian)別(bie)(bie)試(shi)劑盒(he)),為了(le)適配不(bu)同客(ke)(ke)戶的不(bu)同儀(yi)器,快靈鑒(jian)(jian)別(bie)(bie)試(shi)劑盒(he)在(zai)標(biao)準試(shi)劑盒(he)的基(ji)礎上進行部(bu)分(fen)優(you)化,僅涉及檢(jian)測項(xiang)目,試(shi)劑盒(he)靈敏度、特(te)異性等基(ji)本功能(neng)保持一(yi)致(zhi),方便客(ke)(ke)戶根據不(bu)同的需求進行選擇。不(bu)同試(shi)劑盒(he)性能(neng)見表1:
表1:不同鑒(jian)別試劑盒性能(neng)說明
性能 | 非洲豬瘟病(bing)毒P72/CD2V熒光(guang)PCR鑒別試(shi)劑盒 | 非洲豬瘟病毒(du)P72/MGF熒光(guang)PCR鑒(jian)別試劑盒 | 非洲豬(zhu)瘟病毒P72/CD2V/MGF熒光PCR鑒別試(shi)劑盒(三重雙(shuang)通道) | 非洲豬瘟病毒P72/CD2V/MGF熒光PCR鑒別試劑盒(標(biao)準(zhun)版) |
鑒別基因(yin)型 | P72/CD2V | P72/MGF | P72/CD2V/MGF | P72/CD2V/MGF |
所需通(tong)道(dao) | 雙通(tong)道 | 雙(shuang)通道 | 雙通(tong)道 具(ju)備熔(rong)解曲線功能 | 三通道 |
反應方式 | PCR擴增 | PCR擴增 | PCR擴增+熔(rong)解曲線反(fan)應 | PCR擴增 |
反應時(shi)長 | 55min | 55min | 70min(擴增+熔解(jie)) | 55min |
反應體系 | 25μL | 25μL | 25μL | 25μL |
判讀方式 | Ct值判讀 | Ct值判讀 | Ct值與Tm值綜合判讀 | Ct值判讀 |
規格 | 50T/盒 | 50T/盒 | 50T/盒 | 50T/盒 |
靈敏度 | 400copies/mL | 400copies/mL | 400copies/mL | 400copies/mL |
特異性 | ≥99.9% | ≥99.9% | ≥99.9% | ≥99.9% |
敏感性(xing) | ≥99.9% | ≥99.9% | ≥99.9% | ≥99.9% |
穩(wen)定(ding)性 | CV<3% | CV<3% | CV<3% | CV<3% |
UDG酶 | 有 | 有 | 有 | 有(you) |
(三)抗體檢(jian)測(ce)方法 采用間接(jie)ELISA、阻斷(duan)ELISA等方法檢(jian)測(ce)抗體水(shui)平(ping),詳見《非洲豬瘟診斷(duan)技術》(GB/T 18648)
抗(kang)體檢測的(de)意義對于急性疾病的(de)(de)爆發(fa),病毒(du)(du)檢測(ce)(ce)(ce)(PCR)最有(you)用(yong)(yong),血清學(xue)診(zhen)斷價值較低(di),因(yin)為感(gan)染(ran)的(de)(de)豬(zhu)大(da)多(duo)數在(zai)抗(kang)體(ti)產生(sheng)之(zhi)前死亡;非洲豬(zhu)瘟(wen)(wen)變(bian)異(yi)(yi)株(zhu)(包(bao)(bao)括(kuo)基(ji)因(yin)缺失株(zhu)、自然變(bian)異(yi)(yi)株(zhu)、自然弱毒(du)(du)株(zhu)等)的(de)(de)出現,生(sheng)豬(zhu)感(gan)染(ran)該類毒(du)(du)株(zhu)后,潛伏(fu)期(qi)延長,臨床表現輕(qing)微,感(gan)染(ran)該類毒(du)(du)株(zhu)后排(pai)毒(du)(du)滴度低(di)、間隙(xi)性排(pai)毒(du)(du),難以早(zao)期(qi)發(fa)現,因(yin)此(ci)抗(kang)體(ti)檢測(ce)(ce)(ce)的(de)(de)作用(yong)(yong)凸顯。如果沒有(you)接種(zhong)過疫苗,抗(kang)體(ti)的(de)(de)存在(zai)表明感(gan)染(ran)過非洲豬(zhu)瘟(wen)(wen)病毒(du)(du)。上(shang)海(hai)快靈(ling)非洲豬(zhu)瘟(wen)(wen)病毒(du)(du)ELISA抗(kang)體(ti)檢測(ce)(ce)(ce)試(shi)劑盒(he)(間接法)系用(yong)(yong)大(da)腸桿菌表達的(de)(de)非洲豬(zhu)瘟(wen)(wen)病毒(du)(du)P30蛋(dan)白(bai)(bai)包(bao)(bao)被(bei)酶標板,P30蛋(dan)白(bai)(bai)是病毒(du)(du)的(de)(de)主要結構(gou)蛋(dan)白(bai)(bai),在(zai)感(gan)染(ran)的(de)(de)早(zao)期(qi)表達和分泌,可用(yong)(yong)于感(gan)染(ran)后免(mian)疫反(fan)應的(de)(de)的(de)(de)早(zao)期(qi)檢測(ce)(ce)(ce)。
ELISA抗體檢測原理 ELISA試(shi)劑(ji)盒是根據固相酶(mei)聯(lian)免疫吸附試(shi)驗(yan)設計(ji)而成的。在(zai)(zai)本(ben)檢(jian)測(ce)過程中(zhong)(zhong),樣(yang)本(ben)暴露(lu)于包被在(zai)(zai)微(wei)量板孔(kong)內(nei)的非感染性非洲(zhou)豬(zhu)(zhu)瘟抗(kang)原。非洲(zhou)豬(zhu)(zhu)瘟抗(kang)體(ti)(如(ru)果(guo)檢(jian)測(ce)樣(yang)本(ben)中(zhong)(zhong)存(cun)在(zai)(zai))則(ze)將與(yu)酶(mei)標板上抗(kang)原結(jie)合(he)(he),經(jing)洗(xi)滌除(chu)去未結(jie)合(he)(he)的其(qi)他成分后;再加(jia)(jia)入(ru)酶(mei)標記物(wu),與(yu)酶(mei)標板上抗(kang)原抗(kang)體(ti)復合(he)(he)物(wu)發生特異性結(jie)合(he)(he);再經(jing)洗(xi)滌除(chu)去未結(jie)合(he)(he)的酶(mei)標記物(wu),在(zai)(zai)孔(kong)中(zhong)(zhong)加(jia)(jia)TMB底物(wu)液,與(yu)酶(mei)反應(ying)形(xing)成藍色產物(wu),顯色深(shen)淺(qian)與(yu)樣(yang)品中(zhong)(zhong)的特異性抗(kang)體(ti)含量成正相關;加(jia)(jia)入(ru)終止液終止反應(ying)后,產物(wu)變為黃色;用(yong)酶(mei)標儀在(zai)(zai)450nm波長測(ce)定各反應(ying)孔(kong)中(zhong)(zhong)的吸光(guang)值,即可知樣(yang)品是否含有非洲(zhou)豬(zhu)(zhu)瘟抗(kang)體(ti)。
上(shang)海快靈非洲豬(zhu)瘟(wen)病毒(du)ELISA抗(kang)體檢測(ce)試(shi)劑盒(間接(jie)法)使用便(bian)捷、快速、敏(min)感性高、特異(yi)性強,是(shi)理想(xiang)的非洲豬(zhu)瘟(wen)病毒(du)抗(kang)體測(ce)工具。